探讨HA117及DPF3在儿童神经母细胞瘤(NB)中的表达及意义，及其对NB分化的影响和可能机制。
运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组化法检测HA117、DPF3在35例NB、8例节细胞神经母细胞瘤(GNB)和10例神经节细胞瘤(GN)中的表达水平。构建HA117过表达和空载慢病毒，分别转染SH-SY5Y细胞株，构建HA117过表达组和对照组。采用qRT-PCR和Western Blot检测HA117和DPF3的RNA和蛋白质表达水平。采用10 μmol/L维甲酸诱导HA117过表达组和对照组细胞，普通光学显微镜观察细胞形态，免疫荧光法检测神经特异性标志物MAP2蛋白质表达，Western Blot检测HA117过表达组和对照组细胞MAP2、NSE蛋白质的表达情况。
HA117的RNA在NB中的相对表达量为30.14±15.96，明显高于GNB/GN的1.03±0.37(P<0.05)，DPF3的mRNA在NB中的表达量为0.81±0.17，明显低于GNB/GN的3.14±1.09(P<0.05)，与HA117的表达趋势相反。免疫组化检测发现DPF3在GNB/GN中呈强阳性表达，在分化中的NB中呈弱阳性表达，在未分化/分化差的NB中呈阴性表达。过表达HA117可在mRNA和蛋白水平明显下调SH-SY5Y中DPF3的表达。经10 μmol/L维甲酸诱导7 d后，对照组细胞生长明显减慢，细胞长出突起，发生神经元样分化；HA117过表达组SH-SY5Y的MAP2、NSE的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。
HA117和DPF3的表达可能与NB的分化相关，HA117可能通过下调DPF3的表达抑制NB的分化。
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神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童时期最常见的颅外实体瘤之一，占儿童期肿瘤相关死亡率的15%，起源于分化异常或分化阻滞的交感神经系统神经嵴干细胞[1,2]。NB的生物学特性及临床表现异质性大，既可早期发生转移致死，也可在部分病人表现为自然消退或转化成良性肿瘤，分化程度越高预后越好[3]。目前已有研究报道TrkA、TrkB、TrkC、p75、GDNF、Ret及CD133等多种分子参与NB的分化过程，然而NB分化的具体分子机制尚不完全清楚[4]。HA117是本课题组前期研究白血病耐药发现的一个耐药相关序列，在多种恶性肿瘤中高表达，且与先天性肠无神经节细胞症(Hirschspung’s Disease，HD)的发生相关，HA117可能具有抑制胚胎器官正常分化的作用[5,6]。以往的研究显示，HA117的毗邻基因DPF3，与神经分化相关[7]。但HA117是否通过抑制DPF3而参与NB分化，尚无相关报道。本研究通过检测HA117及DPF3在NB中的表达，分析其临床意义；采用慢病毒过表达技术分析HA117对SH-SY5Y分化的影响，初探HA117在NB发生中的作用机制。
收集2009年1月至2016年6月在重庆医科大学附属儿童医院确诊的35例NB，8例节细胞神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma，GNB)和10例神经节细胞瘤(ganglioneuroma，GN)的新鲜切除的手术标本。35例NB中，男19例，女16例；年龄4个月～7岁，平均(91±42)个月。8例GNB中，男5例，女3例；年龄5个月～6岁，平均(82±36)个月。10例GN中，男6例，女4例；年龄6个月～7岁，平均(87±38)个月。所有患儿术前均未进行放化疗。组织收集后分成两部分，一部分用于石蜡包埋，石蜡切片机切成4 μm厚组织切片备用，一部分立即置于－80 ℃冰箱保存。本研究通过了重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会审查[2016年伦审(研)第(133)号]。
神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y。DMEM培养基购自(Gibco)公司、胎牛血清购自(ExCell)公司。TRIzol试剂(Life Technologies)、逆转录试剂盒(TaKaRa)、SYBR Green Ⅱ荧光染料(TaKaRa)、全蛋白提取试剂盒(南京凯基公司)、DPF3兔多克隆抗体(Abcam)、NSE小鼠单克隆抗体(Abcam)、MAP2兔多克隆抗体(Abcam)、β-actin小鼠单克隆抗体(Abcam)、通用型两步法免疫组化检测系统(中彬金桥)、Cy3荧光二抗(联科生物)、HA117慢病毒购自上海吉玛公司、CFX96 Cycler荧光定量PCR仪、凝胶电泳仪(美国BIO-RAD)、转印电泳槽(BID-RAD)、显微镜(Nikon E800，分析软件NIS-ELEMENtS br.3.0)。
采用TRIzol法提取组织和细胞总RNA，紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度，参照Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，逆转录体系为20 μl，采用SYBR GREEN荧光染料qRT-PCR法对cDNA进行扩增，以β-Actin为内参照。引物在上海生工生物工程股份有限公司合成，HA117上游引物：5’-CAGAGTCAGGGACTTCAGCCTTAT-3’，下游引物：5’-CTGTTTCCTTCTCACTCCCAACCA-3’；DPF3上游引物：5’-GACCGAGGCTGTCAAGACCTAC-3’，下游引物：5’-CATGTGATAGCCTCGGTCACAG-3’；β-Actin上游引物：5’-AGACCTGTACGCCAACACAG-3’，下游引物：5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。每份标本设3个复孔，实验重复3次，利用RealTime-PCR detection System软件(BIO-RAD)行半定量分析，比较基因的相对表达量。
石蜡包埋块切片备用，切片厚度为5 μm，经脱蜡、枸橼酸钠抗原修复，3% H2O2室温孵育阻酶，小牛血清封闭，滴加DPF3兔多克隆抗体(1∶200稀释)，4 ℃过夜，经免疫组化试剂盒试剂1(聚合物辅助剂)和试剂2(羊抗兔/小鼠IgG多聚体)作用后，DAB显色、封片、观察。以阳性细胞率判断结果：0～20%阳性细胞记0分，代表阴性；20%～50%阳性细胞记1分，代表弱阳性；50%～100%阳性细胞记2分，代表强阳性。
SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM/高糖培养液，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。参照吉玛慢病毒转染手册，用HA117过表达和空载病毒按MOI 50转染SH-SY5Y细胞，构建对照组和HA117过表达组，病毒转导72 h后继续传代扩增细胞。取对数生长期实验组和对照组细胞以0.5×105个/ml接种于细胞爬片上，24 h后更换为含10 μmol/L RA的完全培养基，隔天换液，作用7 d。
细胞爬片用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透细胞膜，小牛血清工作液封闭1 h后孵MAP2一抗(1∶200)，4 ℃过夜，红色荧光二抗避光孵育30 min，DAPI孵育5 min染核，抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察。
采用凯基全蛋白提取试剂盒提取培养细胞总蛋白，紫外分光光度法检测蛋白浓度，－20 ℃保存备用。以100 μg总蛋白上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，100 V湿转80 min至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加一抗，DPF3(1∶500稀释)、MAP2(1∶250稀释)、NSE(1∶2 000稀释)，内参为β-Actin(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，TBST摇洗，滴加抗兔或小鼠二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL化学发光剂显影，Genesnap凝胶图像分析系统扫描分析，以相对灰度值代表蛋白相对表达量。
用Graphpad Prism 5.0(Graphpad Softwar, Inc, USA)软件进行分析，结果以
±s表示。两样本间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
HA117的RNA在NB中的表达(30.14±15.96)明显高于GNB/GN(1.03±0.37)，差异有统计学意义(P<0.05)。DPF3的mRNA在NB中的表达(0.81±0.17)明显低于GNB/GN(3.14±1.09)，差异有统计学意义(P<0.05)，与HA117的趋势相反。
DPF3在GNB/GN中呈强阳性表达，在分化中的NB中呈弱阳性表达，在未分化/分化差的NB中呈阴性表达。
qPCR检测显示，HA117过表达组RNA表达量(2.016±0.581)较对照组(0.000 168±0.000 142)明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明HA117过表达SH-SY5Y细胞构建成功。HA117过表达组DPF3的mRNA表达量(0.704±0.152)较对照组(2.181±0.401)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示，HA117过表达后DPF3蛋白相对表达量明显降低(图2)，表明HA117可调节DPF3表达。
经10 μmol/L维甲酸(retinoic acid，RA)诱导7 d后，对照组细胞生长速度明显减慢，细胞长出长的突起，发生神经元样分化(图3A、图3B)；而HA117过表达组细胞生长基本不受抑制，无明显细胞突起(图3C、图3D)。免疫荧光染色显示，对照组SH-SY5Y细胞经RA作用后神经特异性标志物MAP2呈强阳性红色荧光(图4A)，HA117过表达组SH-SY5Y细胞红色荧光较弱(图4B)。Western blot检测发现，经RA诱导后，HA117过表达组的MAP2、NSE蛋白的表达水平显著低于对照组(图5)。以上结果表明HA117过表达后，RA诱导SH-SY5Y分化作用受到抑制。
NB占儿童肿瘤的8%～10%，起源于分化异常或分化阻滞的神经嵴细胞[8]。NB的临床和生物学表现因发病年龄、部位、MYCN扩增和分化程度不同而差异较大。部分呈恶性进展，预后较差；部分可自行消退或转化为良性肿瘤。NB的分化程度与患儿预后密切相关，分化程度高的预后较好。有研究报道在过表达MYCN原癌基因的NB转基因模型鼠中，神经嵴分化阻滞可导致神经外胚层前体恶性转化为NB[9]。近年来，成神经细胞分化阻滞与促分化机制已成为研究热点，RA作为经典的促分化剂，已用于Ⅳ期NB多模式治疗后残留病灶的治疗，然而RA的耐药性已成为限制其应用的主要因素[10,11]。NB的分化过程复杂，进一步弄清NB分化的调控机制对于克服RA耐药、开发新治疗方式，有重要参考意义。
许多与神经分化发育相关的转录调节因子在NB的发生中也发挥着重要作用[12]。HA117是本课题组在研究白血病RA多药耐药中发现的一个新序列片段，现已登录Gen Bank(登录号：CB214920)。经生物信息学分析，HA117可能是一个长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，定位于14q24.2，其邻近基因为DPF3和RGS6，两者均参与了神经系统分化发育。HA117在HD样本病变段较正常段组织中异常高表达，而DPF3的表达则与HA117相反，推测HA117可能有抑制肠神经嵴分化作用[7]。已有研究报道RET、PHOX2B等多个分化相关基因共同参与NB及HD的发生发展[13,14,15,16]。那么HA117及DPF3是否也参与了NB的发生发展呢？
本研究首次在分化程度不同的NB中检测HA117及DPF3的表达，发现HA117在分化差的NB中的表达量较分化程度高的GNB/GN中高，而DPF3的表达趋势则与之相反，且差异有统计学意义。提示HA117及DPF3可能与NB分化相关，HA117可能通过下调DPF3而发挥抑制NB分化作用。为进一步验证我们的推测，我们采用慢病毒基因转导方式，在SH-SY5Y细胞中过表达HA117，利用RA诱导该细胞分化，结果HA117过表达组MAP2和NSE较对照组表达量低，提示HA117具有对抗RA诱导NB分化的作用，同时HA117过表达后DPF3表达下调。DPF3又称BAF45c，是染色质重塑复合物SWI/SNF的一个亚基，参与表观遗传及基因调控，除参与神经分化外，还与骨骼肌及心肌的分化发育相关[17,18,19]。本实验中HA117过表达组SH-SY5Y拮抗RA诱导分化作用可能与DPF3下调相关。lncRNA中有相当多的一部分能顺式调节其邻近蛋白编码基因的转录，控制这些发育多样性基因位点的时空表达，并参与与之相关的发育和其它生物学过程[20]。推测HA117作为lncRNA，可能对其邻近的DPF3的表达具有负向调控作用，从而发挥抑制NB分化的作用。
综上所述，我们阐述了HA117及DPF3与NB的分化相关，并在细胞水平证实了过表达HA117可下调DPF3，并抑制RA的诱导分化作用，提示HA117可能通过下调其邻近基因DPF3而发挥抑制NB分化的作用，可能参与了NB的发生发展过程，可作为一个新的分子标志物，用于NB的预后检测和可能的治疗靶标。
利益冲突 无
